重組克隆的篩選與鑒定

一、實驗目的

通過篩選，獲得含目的片段的重組克隆。掌握利用酶切或PCR方法進行陽性克隆的篩選與鑒定步驟。

二、實驗原理

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法，根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。 

由于pUC質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp^r)，可通過Amp抗性來篩選轉化子。受體細胞沒有轉入pUC，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pUC。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行酶切或PCR等進一步鑒定。                   

三、主要試劑

胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂、Amp、IPTG、X-Gal

四、儀器耗材

超凈工作臺、培養箱、平皿、移液器、tip。

五、實驗步驟   

1. 記錄樣品的轉化子總數，白色和藍色菌落各有多少。

2. 記錄對照2的菌落數，計算陽性對照的轉化頻率。

3. 挑取一個白色菌落，接于2mL的LB中

4. 37℃培養過夜。

5. 快速堿裂解法抽提質粒，具體方法參見同實驗二。

6. 酶切，同時以提取的質粒作對照，具體方法參見實驗三。

取2μL質粒進行雙酶切，酶切體系如下：10×bf 2μL，限制酶各0.5μL，H₂O 15μL。37度，2-4hr。0.8-1%瓊脂糖電泳檢測。

    7. 或者使用PCR鑒定陽性克隆，具體方法參見實驗一。

六、注意事項

1. IPTG和X-Gal在培養基上一定要涂勻。

2. 平板如在培養后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。 

思考題：

1. 如果一個DNA 酶解液在電泳后發現DNA 未被切動，你認為可能是什么原因？

2. 請分析實驗結果出現假陽性的具體原因。

3. 實驗結果與分析：如果電泳后（1）只有載體條帶，看不到插入片段的條帶？（2）出現2條以上的條帶？如何解釋。

4. 本實驗的目的是克隆基因Xbc，為基因表達做準備。你認為經過酶切鑒定是否獲得了Xbc的陽性克隆？為什么？并寫出后續的實驗步驟或計劃。

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